| 摘 要：于2003年－2004年间对上海的13个规模化猪场的保育猪进行了集中采样，并结合临床检查、细菌学检测、血清学检测和病毒学诊断等方式对保育猪传染病进行了综合性调查，基本弄清了保育猪传染病的主要致病因子，为采取切实有效的针对性措施提供了技术支持。
关键词：保育猪；传染病；临床检查；细菌学检测；血清学检测；病毒学诊断
近年来，由于从国外的频繁引种以及生猪饲养方式的改变，种猪、商品猪及猪产品流通加剧等方面的原因，猪的疾病日趋严重和复杂化，一些新发传染病及其原有传染病的混合感染也日渐增多。从2001年开始，上海与我国部分省市一样，规模化猪场保育猪的传染病发生呈现明显上升趋势，死亡率也大幅度上升，从而对养猪业构成了新的威胁。为此，于2003年9月至12月及2004年3月至5月份两次对上海的13个规模化猪场的保育猪进行了集中采样，并结合临床检查、细菌学检测、血清学检测和病毒学诊断等方式对保育猪传染病进行了综合调查，试图基本弄清保育猪传染病的感染现状及其危害，为采取切实有效的针对性措施提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 被检样品 上海市6个区（县）13个规模化猪场（其中种猪场6个，商品猪场7个）的保育猪鼻腔棉拭子共220份、直肠棉拭子共138份，作为细菌学检测材料。
无菌采集上海地区13个规模化猪场保育猪的全血或血清样品共238份，供血清学检测和病毒学诊断之用。1.1.2 试剂 Cary-Blair氏运送培养基、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌肉汤、SS琼脂、DHL琼脂、改良马丁肉汤、EMB琼脂、三糖铁琼脂（TSI）、NAD（V因子）、致病性大肠埃希菌诊断血清、侵袭性大肠埃希菌诊断血清、产毒素性大肠埃希菌诊断血清均来源于北京陆桥公司。羊血琼脂、Columbia羊血琼脂均来源于法国梅里埃公司。金黄色葡萄球菌ATCC25923购自中国兽药监察所。
VITEK全自动微生物鉴定系统（法国梅里埃公司）、GPI、GNI+、NFC测试卡（法国梅里埃公司）、API20E、API20NE、APISTREP、APINH试剂条（法国梅里埃公司）。
猪瘟病毒(CSFV)抗原ELISA检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体ELISA检测试剂盒、猪伪狂犬病病毒(PRV)gp1抗体ELISA检测试剂盒来源于美国IDEXX公司；弓形虫正向间接血凝（IHA）检测试剂来源于兰州兽医研究所；猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)抗体ELISA检测试剂盒来源于华中农业大学；猪传染性胸膜肺炎（APP）ELISA检测试剂盒来源于西班牙海波莱公司。
检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒1型和2型（PCV-1、PCV-2）、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)的PCR试剂均来源于北京爱德士元亨生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 临床检查 上海市各区（县）的部分发病猪场进行实地监督调查，询问、检查发病猪群的临床症状，外观病变和病程等情况。
1.2.2 细菌学检查 用灭菌棉拭子采集直肠病料，然后将拭子放入Cary-Blair氏运送培养基，送到实验室后，分别接种于SC增菌肉汤及营养肉汤，37 ℃培养18 h～24 h，分别接种于SS琼脂、DHL平板，37 ℃培养18 h～24 h，可疑菌落接种于TSI斜面，培养18 h～24 h，并用VITEK全自动微生物鉴定系统及API20E进行鉴定，判断是否携带沙门菌、大肠埃希菌。
大肠埃希菌阳性的用致病性大肠埃希菌诊断血清、侵袭性大肠埃希菌诊断血清、产毒素性大肠埃希菌诊断血清进行玻片凝集试验。
用灭菌棉拭子采集鼻腔病料的拭子放入无菌PBS溶液中，送到实验室后，分别接种于Columbia羊血琼脂、巧克力琼脂，置烛缸内，37 ℃培养18 h～24 h，挑选疑似链球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的菌落进行涂片，革兰氏或瑞氏染色，镜检观察其形态。疑似链球菌的纯化后进行VETEK GPI卡或用APISREP检测。疑似巴氏杆菌的纯化后进行VETEK NFC卡或API20NE检测。疑似胸膜肺炎放线杆菌的接种于Columbia羊血琼脂后，点种金黄色葡萄球菌，置烛缸内，37 ℃培养18 h～24 h，观察是否有卫星生长现象，是否溶血。疑似副猪嗜血杆菌的接种加入V因子和不加V因子的巧克力琼脂置烛缸内，37 ℃培养18 h～24 h，观察其V因子及X因子依赖性试验，并进行APINH试剂条检测。
1.2.3 血清学监测 按试剂盒说明书规定的操作程序进行。
1.2.4 病毒学诊断
1.2.4.1 DNA的提取 将血清8 000 r/min离心5 min，取上清100 μL ,加入500 μL消化液和10 μL蛋白酶K，混匀后置55 ℃水浴中过夜；加600 μL酚/氯仿/异戊醇混合液，颠倒混匀，12 000 r/min离心10 min；取500 μL上清置于新管，加入500 μL异丙醇，混匀，置液氮中3 min；取出样品管，室温融化，13 000 r/min 离心15 min；弃上清，沿管壁缓缓滴入1 mL 700 mL/L乙醇，轻轻倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1 min，真空抽干15 min；取出样品管，用30 μL灭菌去离子水溶解沉淀，作为模板备用。
1.2.4.2 RNA的提取 取血清100 μL，加入300 μL变性液、300 μL酚/氯仿/异戊醇混合液和30 μL乙酸钠溶液，颠倒混匀，冰浴15 min，4 ℃ 10 000 r/min离心15 min；取300 μL上清置于新管，加入300 μL异丙醇，混匀，置液氮中3 min ；室温融化，4 ℃ 15 000 r/min 离心20 min；弃上清，沿管壁缓缓滴入1 mL 700 mL/L乙醇，轻轻旋转后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1 min, 真空抽干15 min；用9 μL DEPC水和1 μL RNA酶抑制剂溶解沉淀；－20℃储存备用。
1.2.4.3 病毒DNA的PCR扩增 每份总体积20 μL。取16 μL PCR反应液、2 μL Taq DNA聚合酶、2 μL模板DNA，混匀，放于PCR扩增仪上。PR病毒扩增条件为：94 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s,72℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min；猪细小病毒扩增条件为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次；72℃延伸7 min；PCV2扩增条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。
1.2.4.4 RT-PCR扩增 PRRSV的扩增采用两步法，即RT反应条件为16 μL反转录反应液，1 μL RNA酶抑制剂，1 μL反转录酶，2 μL样品RNA，42 ℃ 1 h，98 ℃ 5 min；PCR反应条件为：16 μL PCR反应液，2 μL Taq DNA聚合酶，2 μL反转录产物，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。
2 结果
2.1 保育猪临床检查结果
我们所调查的13个猪场隶属于6个区（县），基本上都是规模化猪场（户），生产母猪圈存栏数从200头至1 500头不等，均为外来猪种为主要血缘构成的“三洋猪”或“二洋一土”的品种猪。猪场大多建造于20世纪80年代至90年代，猪舍的结构布局不尽合理，设施设备陈旧，但猪群饲养密度普遍超标，没有一家猪场能实行全阶段的“全进全出”生产模式，受调查的养猪场都制订了各自的免疫程序和消毒制度。绝大多数猪场的仔猪早期料和保育猪饲料购自饲料公司，其余阶段的猪饲料一般购入饲料原粮和饲料添加剂后自己加工而成。各养猪场的仔猪断奶时间一般为21日龄～35日龄。
患病保育猪多发病于5周龄～8周龄，发病率和死亡率分别为6%～38%和2%～17%。患病猪主要表现体温升高（40.5℃～41℃），食欲下降，扎堆，渐进性消瘦，被毛粗乱，皮肤苍白，眼睑水肿，呼吸困难或明显咳喘。有的在耳部、腹部可见出血性紫红色斑块，眼睛半闭，眼角分泌物增多，小部分仔猪拉稀，偶见病猪有抽搐、共济失调等神经症状。患猪增重缓慢，发育不良，易成为僵猪。剖检可见肺水肿、充血、出血、气肿、萎缩或增生等不同病理变化，肺门淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结肿大、出血，脾肿大，肾出血，脑充血或出血，心包积液等。
2.2 保育猪带菌情况调查结果
经细菌培养和鉴定，表明保育猪带菌感染状况比较严重。在检出的6个常见的病原菌中，链球菌检出率最高(33.2%)，其次分别为大肠埃希菌(22.5%)、巴氏杆菌(11.4%)和副猪嗜血杆菌(11.4%)，沙门菌为5.1%，胸膜肺炎放线杆菌最低，阳性率为0.91%(表1)。
2.3 保育猪传染病的血清学检测
经血清学检测， 因6个猪场的仔猪已实施PRRS免疫，阳性率最高（57.6%），其他传染病的血清阳性检出率分别为PCV-2（10.9%），PR（7.56%），APP（4.62%），弓形虫（0％），CSFV抗原的阳性检出率为2.52%(表2)。
2.4 保育猪血清样品的病毒学诊断结果
经PCR检测，在4个猪场检出PRRSV阳性4份，占总样品数的1.68%；在3个猪场检出细小病毒（PPV）阳性样品3份，占总样品数的1.26%；在2个猪场检出PRV阳性2份，占总样品数的0.8%；在2个猪场检出PCV-2阳性2份，在5个猪场检出PCV-1阳性样品15份，分别占总样品数的0.8%和6.3%（表3）。
表1 保育猪带菌情况调查结果
Table 1 Results of bacterial detection in nursery pigs
|
阳性率
Positive rate
场别farm |
沙门氏菌
Salmonella |
链球菌
Streptococcus |
嗜血杆菌
Haemophilus parasuis | | 
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